Callogénèse et vitrovariation en présence de chlorure de Sodium

Callogénèse et vitrovariation en présence NaCl à ârtir d’embryons de porte-greffes d’agrumes.

ROCHDI Atmane1, EL YACOUBI Houda1, ESSAFI Noureddine1, ABOUSALIM Abdelhadi2

1Univ. Ibn Tofail, Fac. Sc., BP 133, Kénitra 14000, Maroc. 2IAV HASSAN II, Rabat, Maroc.

Résumé :

L’induction de la callogenèse, à partir d’embryons mûrs, est significativement améliorée par le milieu de base MT (Murashige et Tucker, 1969) additionné de 2,4-D et de BAP. Le criblage de vitrovariants en présence de chlorure de sodium a révélé que la concentration 8 g l-1 NaCl peut être utilisée comme pression sélective ; mais qu’une durée de 4 semaines est insuffisante pour distinguer la réaction des amas callogènes vis à vis de la contrainte saline. En outre, à 9 g l-1 NaCl, le taux de germination des graines et des embryons a été réduit de plus de 50%. En revanche, la survie de quelques lignées cellulaires pendant plus de 2 mois de culture, démontre la sélection de cals tolérants. D’autre part, la réponse in vitro des amas callogènes à la salinité montre que les cals de Citrus aurantium sont relativement plus sensibles que ceux de Poncirus trifoliata.
Abstract: Callogenesis induction from embryos has been meaningfully improved by MT (Murashige and Tucker, 1969) medium supplemented with 2,4-D and BAP. Moreover, screening of the variants lines by different concentrations of sodium chloride revealed that 8 g l-1 NaCl can be used as pressure of selection to the salinity tolerance and that 4 weeks is insufficient to distinguish the behaviour of cells. Furthermore, the rates of seed and embryo germination were reduced by more than a half with 9 g l-1 NaCl. However, the survival of some calli in presence of this same salt concentration, during at least two months of culture, confirms the selection of salt-tolerant cell lines. On the other hand, the in vitro response to NaCl stress of rootstocks in callus culture shows that Citrus aurantium are relatively more sensitive than Poncirus trifoliata.

Mots-clés : Agrumes, Citrus , Callogenèse, Vitrovariation.

Introduction

La salinité limite l’extension des végétaux et constitue une contrainte pour le développement agricole. Au Maroc, le problème de salinité se pose avec de plus en plus d’acuité, à cause de plusieurs facteurs liés à la sécheresse et à l’intensification de l’agriculture. A ce sujet, le secteur agrumicole mérite une attention particulière en raison de son importance socioéconomique [76 000 Ha de superficie ; 100 000 emplois permanents; 21 x 106 journées de travail/an et troisième source de devise pour le Maroc], et de la compétitivité de plus en plus forte à laquelle il est confronté.
La recherche de porte-greffes tolérants vis-à-vis du stress salin est une voie alternative pour surmonter ce problème de salinité et permettre le développement du secteur agrumicole (Ollitraut et al., 2000). En effet, la sélection in vitro de lignées cellulaires a été recherchée dans le but de développer des variants plus tolérants aux sels. Ainsi, à titre d’exemple Citrange troyer (Garcia-augustin et Primo-Millo, 1992) et Citrus limon (Piqueras et al, 1994) ont fait l’objet d’amélioration de leur tolérance vis à vis de la salinité. L’objectif du présent travail est la sélection, en culture in vitro, de lignées cellulaires tolérantes au stress salin chez les porte greffes d’agrumes Citrus aurantium et Poncirus trifoliata.

Matériel et méthodes

Les graines de Citrus aurantium et Poncirus trifoliata sont décortiquées (enlèvement des téguments externes) puis trempées dans de l’éthanol 70° (2 minutes) et désinfectées dans une solution d’hypochlorite de sodium à 25% (15 minutes). Après rinçage à l’eau distillée stérile, les embryons sont excisés sous hotte à flux laminaire puis incubés dans l’un des trois milieux d’induction : MS (Murashige et Skoog, 1962), MS/2 (MS dont les macro-éléments sont dilués de moitié) et MT (Murashige et Tucker, 1969). Ces milieux sont additionnés d’extrait de malt à 500 gl-1 et de saccharose à 30 gl-1 Pour l’induction de cal, l’effet du 2,4-D est testé à 0,2 et 0,4 mg l-1 en combinaison avec le BAP à 0,4 mgl-1. Le milieu est solidifié par 8 g l-1 d’Agar (Difco Bacto Agar).
L’incubation est réalisée à 25°C. Après 4 semaines à l’obscurité, les explants sont ensuite transférés sous une photopériode de 16 h et un éclairement de 2000 lux.

Les conditions callogènes étant définies, un stress salin est appliqué par l’incorporation de NaCl dans le milieu, en vue d’orienter la vitrovariation et de cribler des lignées cellulaires tolérantes. Ainsi, l’effet de quatre concentrations de sel (NaCl) : 0 ; 5 ; 7 et 9 g l-1 est étudié. Les paramètres adoptés pour évaluer le comportement des deux porte-greffes, vis à vis de la salinité, en phase de callogenèse, sont : le taux d’induction, la couleur, la texture, la croissance (surface ‘Surf ‘ et masses de matière fraîche ‘MF ‘et sèche ‘MS ‘) et la capacité organogène des cals.

La dose saline sélective étant déterminée, son effet est aussi examiné sur la germination des graines (30 graines réparties en 3 boites de pétri contenant du papier filtre imbibé de la solution de NaCl) et sur des embryons excisés (30 embryons mis en culture en tubes à essai, renfermant le milieu de base MT sans phytorégulateurs).
Le dispositif expérimental est complètement aléatoire. Les données sont soumises à l’analyse de la variance et la comparaison des moyennes par le test de Duncan.

RESULTATS

Induction de la callogénèse

Dans nos conditions expérimentales, trois types de cals ont été obtenus : i) des cal compacts, de couleur blanc-jaunâtre à jaune-verdâtre et présentant une capacité caulogène; ii) des cals friables, de couleur beige-jaunâtre (quelquefois surmontés par des excroissances filamenteuses ou granuleuses; d’apparence blanchâtre lustré) et iii) des cals hyper-hydriques sans potentiel de néoformation. La fréquence de formation de ces types de cals est de 45 ; 35 et 20 % respectivement.
Le suivi de la croissance des cals (Tab.I) montre qu’après 12 semaines de culture, la moyenne de la surface (tous les porte-greffes confondus) s’élève à 22,5 mm2 (28,5 mm2 sur MT et 19,5 mm2 pour chacun des autres milieux). Par contre, les masses de matières fraîche et sèche sont respectivement de 73,3 et 14,3 mg (soit 98,2 ; 61,4 ; 60,4 mg MF et 18,4 ; 12,7 ; 12,4 mg MS, respectivement sur MT, MS et 1/2 MS ).
L’analyse de la variance (Tab.II) montre des différences hautement significatives entre les divers milieux de culture pour les différents critères de croissance (Surf, MF et MS des cals). Elle confirme la supériorité du milieu MT qui s’avère le plus adéquat à l’initiation callogène; les autres milieux étant dans un même groupe homogène selon le test de Duncan (effet de MT > effet de MS et 1/2 MS).
Par ailleurs, la caulogenèse est stimulée par la combinaison de BAP avec une faible concentration d’auxine (0,2 mg l-1 de 2,4-D); la concentration 0,4 mg l-1 de 2,4-D étant plus propice à la callogenèse. Après 4 semaines, le taux d’initiation des cals atteint en moyenne (porte-greffes et milieux confondus) 95 % avec 0,4 mg l-1 d’auxine (100% sur MT; 93% sur 1/2 MS et 91% sur MS) contre 89 % avec 0,2 mg l-1 d’auxine (92% sur MT; 95% sur 1/2 MS et 81% sur MS). L’analyse de la variance confirme une différence, hautement significative, entre les deux concentrations de 2,4-D utilisées et pour l’interaction milieux-régulateurs de croissance. Par contre, les porte-greffes ne montrent pas de différences significatives pour l’induction des cals.
En conclusion, l’induction et la prolifération des cals, sont favorisées par l’emploi du milieu MT additionné de 0,4 mg l-1 de 2,4-D et de BAP.

Impact de NACL sur la callogénèse

L’analyse par l’A.F.C. de quelques variables qualitatives telles que la couleur et la présence de structures organogènes, permet d’apprécier leurs liaisons avec le traitement salin. Ainsi, la présence de bourgeons différenciés et de pousses feuillées (33 %) et les couleurs jaunâtre et beige-jaunâtre des cals semblent caractéristiques du traitement 5 g l-1 de NaCl,. Les couleurs blanchâtre et blanc-jaunâtre sont typiques de la dose saline 7 g l-1 de NaCl, pour laquelle la présence de structures méristématiques (amas de petits bourgeons et de structures en feuilles sans phyllotaxie précise) est enregistrée sur 25 % des cals de chaque porte-greffe. Par contre, avec 9 g l-1 de NaCl, seuls quelques cals (10 %) montrent une aptitude morphogène.
L’évolution des caractères quantitatifs (Tab.III) montre que 4 semaines de culture est insuffisante pour discriminer le comportement des cals vis à vis de NaCl. En effet, l’analyse de la variance indique un effet hautement significatif de la variable durée de culture et le test Duncan distingue deux groupes homogènes (4 ≠ 8 et 12 semaines).

La croissance du cal est différemment influencé par les doses salines utilisées. Par rapport aux témoins, la surface des amas callogènes est réduite de 12, 40 et 52% respectivement avec 5, 7 et 9 gl-1 de NaCl. L’analyse statistique montre que 5 g l-1 de NaCl n’affecte pas sensiblement l’accroissement des cals. Par contre, l’effet des niveaux salins plus élevés est significatif au seuil de 5%.

La comparaison des paramètres quantitatifs (Tab. III), dans le milieu témoin et sous l’effet de la dose saline la plus élevée (9 g l-1 de NaCl), montre que l’évolution de la MF et MS du cal est également influencée par le sel. L’analyse statistique décèle un effet significatif de NaCl sur la régression des caractères quantitatifs de la croissance et cette diminution est relativement plus importante pour C. aurantium que pour P. trifoliata. Ainsi, après 12 semaines de culture (trois subcultures successives), la réduction par rapport aux témoins est de 10 et 23 % pour Poncirus et de 47 et 40 % pour Citrus, respectivement pour MF et MS. Par contre, la variation du rapport MF/MS révèle un comportement inverse des porte-greffes : réduction pour C. aurantium (-11%) et amélioration pour P. trifoliata (+18%). En effet, la teneur relative en eau des cals montre une amélioration pour les cals stressés de Poncirus contre une légère régression pour ceux de Citrus (+3,6% et -2,2 % respectivement). Cette différence d’évolution d’hydratation, quoique non significative vis-à-vis du facteur porte-greffe, laisse présager l’existence d’une aptitude d’ajustement du potentiel osmotique par les cals tolérants la salinité de Poncirus trifoliata.
La réponse in vitro des amas callogènes à la salinité des deux porte-greffes montre que les cals de Citrus sont relativement plus sensibles que ceux de Poncirus. En effet, La variation de la croissance entre la fin de la 4ème et de la 12ème semaine de culture (Tab. IV) montre que la réduction des MF et MS est plus marquée pour C. aurantium (56 et 66 %) que pour P. trifoliata (10 et 22 %). Signalons aussi qu’à la fin de la 12ème semaine de culture, la dose saline la plus élevée (9 g l-1 de NaCl) entraîne des taux de nécrose relativement plus élevés chez les cals du Citrus.
Cette étude montre aussi que la concentration 9 g l-1 de NaCl peut être utilisée pour le cal, comme pression sélective de la tolérance à la salinité. D’autre part, en présence de cette même dose en sel, le taux de germination des graines et des embryons excisés est réduit de plus de la moitié par rapport aux témoins (87 , 65 , 41% de graines et 90 , 75 , 43% d’embryons ayant germés, respectivement à 5 , 7 , 9 g l-1 de NaCl). En conséquence, la survie de quelques lignées cellulaires, issus des cals induits à partir des embryons, en présence de la concentration de 9 g l-1 de NaCl, confirme la sélection de vitrovariants tolérants à la salinité.

Discussion

Le succès et l’application des techniques de vitroculture résultent d’une meilleure connaissance des besoins nutritionnels des cultures. En effet, chez les ligneux, plusieurs études ont montré l’influence morphogène de la composition des milieux (Bergmann et Stomp, 1992). Chez les porte-greffes d’agrumes étudiés, le milieu MT, favorable à la réactivité des embryons excisés, diffère de MS par sa teneur élevée en vitamines (acide nicotinique, pyridoxine et thiamine). Selon George et Sherrington (1984), les micro-éléments et les vitamines sont apportés dans le milieu afin d’éviter toute carence éventuelle. En outre, la composition du milieu MT, en macro-éléments, est deux fois plus élevée que celle du milieu 1/2 MS ; ceci ne semble pas avoir eu d’influence sur la prolifération des amas cellulaires, si l’on juge par l’absence de différences entre les résultats obtenus sur les milieux MS et 1/2MS. Par conséquent, le cal des porte-greffes étudiés apparaît plus exigeant en vitamines qu’en macro-éléments.

Par ailleurs, le déclenchement de toute morphogenèse en culture in vitro est généralement contrôlée par le rapport de deux classes de substances phytomorphogènes : les auxines et les cytokinines. Dans notre cas, l’induction et la prolifération du cal, sont obtenues sous l’action du 2,4-D en association avec le BAP. Chez plusieurs ligneux, le 2,4-D est l’auxine la plus active dans la production du cal (Evans et al., 1984). Le 2,4-D est également utilisé pour induire l’embryogenèse indirecte, dans laquelle l’auxine joue un rôle à la fois de substance mitogène et déterminant de l’état embryogène (Sharp et al., 1980). Cependant, son élimination ou la réduction de sa concentration est souvent nécessaire pour un développement normal des embryons (Ammirato, 1989). En ce qui concerne l’organogenèse, le 2,4-D peut être moins important que d’autres auxines ou même complètement inhibiteur du processus organogène (Beloualy, 1991). Conjointement à l’auxine, la cytokinine BAP, est aussi utilisée en vue d’améliorer les capacités morphogènes des explants (Duran-Villa et al., 1989). Dans notre cas, le BAP combiné à l’apport du 2,4-D a permis une nette amélioration de la prolifération cellulaire et de la réactivité des explants.

L’orientation de la vitrovariation et le criblage de lignées cellulaires tolérantes au sel, sont recherchés par l’emploi de différentes concentrations de chlorure de sodium. Sur la base des critères étudiés, la dose sélective est de 9 g l-1 NaCl. La bibliographie montre que pour les cals des agrumes, le niveau salin sélectif en culture in vitro se situe dans un intervalle allant de 5 à 10 g l-1 NaCl (Ben Hayyim, 1987 ; Beloualy et Bouharmont, 1993 ; Piqueras et al., 1994). Par ailleurs, certaines études ont démontré qu’il existe une relation positive entre la réponse au sel au niveau cellulaire et de la plante entière, quand les cals de la première subculture sont utilisés pour l’évaluation de la tolérance à la salinité au niveau cellulaire (Rus et al., 2000). D’autres ont prouvé que les cals issus d’embryons ont le même degré de sensibilité au NaCl que les plantules en culture in vitro (Bourgeais-Chaillou et al., 1992). Pour le cas des porte-greffes étudiés, la concentration en sel retenue (9 g l-1) a été testée et a entraîné la réduction de plus de la moitié des taux de germination des graines et des embryons excisés.

En conséquence, la survie à ce niveau même de stress (9 g l-1 de NaCl), de quelques cals démontre la sélection de lignées cellulaires tolérantes à la salinité. Des lignées variantes ont été aussi sélectionnées à partir de cellules somatiques des porte-greffes C. sinensis (Libal-Weksler et al., 1992) et C. limon (Piqueras et al., 1996). Ben-Hayyim et al. (1987), quant à eux, ont confirmé la stabilité du caractère de tolérance au stress salin et ont noté que les tissus adaptés accumulent moins d’ions Na+ et Cl- et que la tolérance des cellules des Citrus peut être associée à la rétention de K+.

Conclusion

La prolifération du tissu callogène, à partir d’embryon, est obtenue par action de l’auxine 2,4-D combinée à la BAP. Le milieu MT, enrichi en vitamines, est favorable à la callogenèse par comparaison aux milieux MS ou 1/2 MS. L’orientation de la vitrovariation au niveau des tissus callogènes est recherchée par l’emploi de différents niveaux de stress salin et la concentration de 9 g l-1 est retenue comme pression de sélection. En effet, cette dose saline réduit, de plus de la moitié, le taux de germination des graines et des embryons excisés. Par contre, la survie à ce niveau même de stress, de quelques cals confirme la sélection de lignées cellulaires tolérantes à la salinité pour les porte-greffes d’agrumes Citrus aurantium et Poncirus trifoliata. D’autre part, la réponse in vitro des amas callogènes à la salinité des deux porte-greffes montre que les cals de Citrus aurantium sont relativement plus sensibles que ceux de Poncirus trifoliata.

Table des matières :

Tab. I :
Influence de la composition du milieu de culture sur la croissance des cals de C. aurantium (C. a) et P. trifoliata (P. t)

Tab. II :
Analyse de la variance de l’effet de la composition du milieu de culture sur les paramètres de croissance du cal (porte-greffes confondus)

Tab. III :
Evolution de la croissance des cals de C. aurantium (C.a) et P. trifoliata (P.t) en fonction de la concentration en sel du milieu de culture

Tab. IV :
Variation de la croissance relative entre 4 et 12 semaines, des cals de C. aurantium et P. trifoliata en fonction de la concentration en sel du milieu de culture

Bibliographie en téléchargement.

Bibliographie